На главную страницу

УДК 619: 579. 887. 111.
Кирьянов Е. А. Микоплазмы и Л — формы бактерий в патологии животных. Лекция — Уссурийск, Приморский сельскохозяйственный институт, 1983.
Лекция предназначена для студентом и слушателей ФПК специальностей 1507 и 1506. Табл. 2, библ. 4.
Рецензент: доцент Мешков Н. Н. Приморский сельскохозяйственный институт, 1983

План лекции
1. История открытия микоплазм и Л — форм бактерии.
2. Биологические свойства:
Морфология.
Физиология.
Устойчивость.
Антигенные свойства.
Патогенные свойства.
3. Систематика микоплазм.
4. Заболевания, вызываемые микоплазмами и их специфическая профилактика.

История микробиологии микоплазм началась с открытия Нокаром и Ру (1898) возбудителя перипневмонии крупного рогатого скота, достигла своего апогея, когда в 1972 году состоялся Всесоюзный симпозиум по проблеме микоплазм и их роли в патологии сельскохозяйственных животных. На собрании ученых принята программа, поручающая Всесоюзному институту экспериментальной ветеринарии осуществить координацию научных исследований по проблеме микоплазм и микоплазмозов сельскохозяйственных животных. Одновременно предлагалось в ведущих институтах создать рабочие группы и организовать исследовательские лаборатории по изучению региональных вопросов, связанных с распространением микоплазм и их ролью в патологии животных.
Становление учения о микоплазмах и Л-формах бактерий сопровождалось многочисленными дискуссиями.

Продолжительные годы согласовывалось мнение о таксономическом положении микроорганизмов. В сентябре 1969 года в Женеве в рамках ВОЗ и ФАО состоялось совещание, имевшее целью организацию совместных исследований микоплазм, выделенных от животных, и заболеваний, вызываемых ими. На совещании обсуждалась также возможность создания международных и региональных справочных центров и групп специалистов по сравнительному изучению микроорганизмов, выделенных от животных и людей.
Современная научная информация, представленная монографическими изданиями: семейство микоплазм и Л-формы бактерий (В. Д. Тимаков, Г. Я. Каган, 1967), респираторный микоплазмоз птиц (А. С. Серебряков, Г. А. Грошева, В. А. Шубин, 1970), микоплазмозы животных (Я. Р. Коваленко, 1976), респираторный микоплазмоз у детей (И. Г. Шройт и др., 1975), свидетельствует о широком распространении микоплазм в природе, подчеркивает их значение в патологии людей и животных. Вместе с тем обзор научной информации показывает, что многие вопросы этиологии, патогенеза и диагностики различных патологических процессов, связанных с микоплазмами, остаются не решенными, что оставляет микоплазмозы в числе актуальных проблем современной патологии сельскохозяйственных животных, требующих дальнейшего изучения.

Биологические свойства микоплазм.
Морфология. Микоплазмы чрезвычайно полиморфные микроорганизмы. В мазках, приготовленных из органов и культур, обнаруживаются округлые, кольцевидные, овальные, кокковидные и нитевидные образования. Клетки имеют различную величину, которая по данным различных авторов, колеблется от 125 до 600 нм. Вместо клеточной стенки они имеют трехслойную мембрану, цитоплазму с ядерной субстанцией, гранулами и вакуолями. Мембрана состоит из полярных липидов и протеинов. В отличие от бактериальных клеток в состав микоплазм входит стерол, составляющий до 20 проц. общего мембранного липида. Основным компонентом паразитических видов является свободный и этерифицированный холестерин, обеспечивающий энергию и структурную организацию клетки.

Химический состав клетки состоит из белка в количестве 59,80 проц., общего азота — 11,20 проц. нуклеиновых кислот — 6,63 проц., липидов — 5,10 проц., и жирных кислот — 2,35 проц. Количество белка в сухой массе микоплазм колеблется от 54 до 62 мг проц., в его состав входит до 17аминокислот. Кроме этого, белковый компонент включает различные ферменты, играющие основную роль в метаболизме микробной клетки.
Геном клетки микоплазм состоит из циркулярной двух спиральной ДНК. При этом репликация генома происходит, как правило, в одной точке роста. Полагают, что форма клетки зависит от цикла развития микроорганизма.
Физиология. Микоплазмы, в силу своих структурных особенностей, слабо адаптируются на питательных средах. Одни штаммы вызывают помутнение среды, другие образуют легкую пленку. Одни штаммы растут в верхнем слое питательной среды, другие — в придонной части. На полужидких средах с ростовыми добавками микоплазмы растут по уколу или образуют взвешенные крошковатые колонии.
На плотных питательных средах микоплазмы формируют характерные колонии, напоминающие яичницу-глазунью. При этом в первичных посевах рост начинается на 3 и 7 сутки, адаптированные же штаммы растут значительно быстрее. В случае длительного культивирования микоплазмы в глубине агаровой среды образуют полосы преципитации, являющиеся следствием ферментной активности. Колонии прорастают глубоко, поэтому их снимают вместе с агаром. Размер колоний не превышает 2 мм. Бывают также колонии меньших размеров, которые можно видеть, вооружившись лупой или микроскопом.
Колонии микоплазм, изолированные из патологического материала и принадлежащие разным видам, морфологически сходны. Подмечено, что увеличение периода инкубации повышает частоту выделения патогена. Поэтому посевы на питательных средах рекомендуется выдерживать до 10 дней.
Рост микоплазм определяется присутствием различных питательных веществ. Из белковых веществ для их роста нужен альбумин, стерины, углеводы и витамины. Они нуждаются в РНК и ДНК и муцине. При этом лучшей добавкой к питательной среде является сыворотка лошади и свиньи. Сыворотки других видов животных менее пригодны, подчас оказывают ингибирующее действие. Микоплазмы и процессе роста избирательно потребляют аминокислоты, к тому же необходимо, чтобы эти аминокислоты были в определенных соотношениях. Незаменимыми при этом оказались аргинин, изолейцин, метионин, фенилаланин, аспарагин. Присутствие аминокислот, а также ДНК особенно необходимо в первичных посевах, когда микоплазмы еще не адаптировались к новым условиям. Подмечена также потребность микоплазм в фосфолипидах, солях желчных и жирных кислот.
В процессе изучения метаболизма установлена биохимическая активность микоплазм. На основе этого признака микоплазм разделяют на ферментативно активные и ферментативно неактивные. Первые сбраживают различные сахара, вторые не обладают таким свойством. Многие штаммы обладают также протеолитической активностью. Некоторые штаммы в сывороточных средах редуцируют метиленовую синь, обладают пероксидазной активностью, продуцируют гемолизин и гемагглютинин, образуют экзотоксин.
Существует несколько гипотез репродукции микоплазм. Одна из них представляет их развитие как последовательную смену пяти фаз: зернистой, волокнистой, разветвления, образования цепочек и их распада на зерна. Согласно второй теории цикл развития микоплазм состоит из двух фаз. В первой фазе происходит образование гранул, во второй — разрыв волокон и отпочковывание шаровидных телец. Существует также мнение, что размножение микоплазм происходит по типу аутолиза, в результате которого появляются вакуоли, наполненные волокнистыми структурами. В последующем стенка вакуоли разрывается, содержимое оказывается в окружающей среде и цикл репродукции повторяется. Исследования в световом и фазовоконтрастном микроскопах показали, что началом репродуктивной субстанции является элементарное тельце, из которого вырастает гомогенная нить, несущая терминальное образование, такой же величины, что и элементарное тело. На весь цикл образования микробной клетки уходит 12—18 часов. Полагают о наличии в структуре микоплазм мицелиальных образований, хорошо просматриваемых при электронной микроскопии. Считают, что характер мицелия влияет на форму колоний. На этой основе различают три формы колоний: тип А, характеризующийся длиннонитчатым мицелием, тип В — с коротким,
скудно развивающимся мицелием; третий тип — мицелий занимает промежуточное положение. Развитие мицелия обуславливается составом питательной среды, в частности, присутствием холестерина и видовой принадлежностью сыворотки.
По форме и архитектурному оформлению микоплазмы сходны с Л-формами бактерий. Последние от них отличаются врастанием в среду колоний плотным их центром с нежным кружевным краем. Л-формы имеют два типа колоний, известные под названием ЗВ и ЗА. Колонии типа ЗВ имеют слизистую консистенцию, врастают в глубь среды. Клетки Л-форм сохраняют клеточную стенку, фаговосприимчивые рецепторы, способны лизироваться. В (настоящее время Л-трансформация известна у многих форм бактерий, они описаны также у спирохет.
Превращение бактерий в Л-формы происходит по многим причинам и осуществляется различными путями. В одних случаях в результате незавершенного морфогенеза образуются шаровидные тела, превращающиеся в разнообразные формы, образующие Л-колонии типа ЗВ, в других — происходит разрыв клеточных стенок с освобождением содержимого, из которого формируются Л-колонии.
Дифференциация микоплазм от Л-форм бактерий сложный процесс. Окончательное слово в решении вопроса заключается в сравнительном и адекватном изучении структуры данных микроорганизмов.
Устойчивость. Рост микоплазм происходит в диапазоне 18—42°, что зависит от видового состава микроорганизмов. Оптимальной температурой для роста патогенных микоплазм человека и животных является 37—38°. Возбудитель устойчив к низким температурам. При —20° бульонные культуры сохраняются до года, при —4° — не более двух недель. При комнатной температуре жизнеспособность микоплазм сохраняется до 90 дней, в условиях термостата 15—75 дней. Микоплазмы погибают при температуре 60о в течение 10 минут. Они хорошо переносят леофильное высушивание, многие годы сохраняют биологические свойства. Микоплазмы растут при рН 7,5—8,0. Увеличение или снижение рН сказывается избирательно для микроорганизма. Они слабо адаптируются к гипо- и гипертоническим условиям. Чувствительны к ультразвуковой дезинтеграции. Действие ультразвука при частоте 9 кгц и температуре 4° инактивирует их. Губительно также действуют ультрафиолетовые лучи. Гибель микоплазм наступает в течение трех часов.
Микоплазмы разных видов обладают относительно высокой резистентностью в отношении антибиотиков и других лекарственных препаратов. Было установлено, что антибиотики, в частности, пенициллины действуют ингибирующе на синтез клеточной мембраны. Наиболее выраженным действием из антибиотиков обладает тилозин. Стрептомицин, эритромицин и тетрациклины весьма слабо влияют на микоплазм, добавление их к питательной среде способствовало появлению мутантов и устойчивых рас. Не оказывают также ингибирующего эффекта на микоплазм сульфаниламидные препараты. Из других лекарственных препаратов отмечено губительное действие на микроорганизм фурановых соединений. Возбудители очень чувствительны к дезинфицирующим веществам.
Антигенные свойства. По изучению антигенных свойств микоплазм накоплена значительная информация. Исследование этого вопроса ведется в четырех направлениях. Главным из этих направлений является изучение видовых антигенных различий и разработка единой серологической классификации. Не менее важным является установление химического состава. Изыскание методов изготовления антигенов. Все это позволит, в конечном итоге, осуществить более совершенную идентификацию и серодиагностику заболеваний.
У возбудителей семейства микоплазм к настоящему времени установлены многие антигенные свойства. У них, в частности, обнаружена способность продуцировать агглютинины, преципитины, комплементосвязывающие антитела, гемагглютинины, гемолизины. Показано, что антигенная структуру микоплазм очень сложная, остается пока достаточно не изученной. Дело в том, что морфологически микоплазмы не отличимы друг от друга, хотя и открыты некоторые различия в быстроте роста, в морфологии колоний и клеточных элементов. Они несут также непостоянные патогенные свойства. Поэтому идентификация патогенов осуществляется комплексно. В этой связи учитываются все биологические свойства патогенов, но основное слово остается за специфическими серологическими реакциями. Для этой цели применяют реакцию агглютинации, гемагглютинации, реакцию задержки гемагглютинации, пробу задержки роста, реакцию ингибиции метаболизма, реакцию связывания комплемента, реакцию преципитации. Для типизации микоплазм в последние годы широко применяется реакция иммунофлуоресценции. Перечисленные методы позволяют проводить видовую дифференциацию микоплазм. При этом даже в пределах вида могут выявляться серологические варианты. Так, например, возбудителями микоплазмоза птиц являются 3 вида возбудителя: М. галинарум, М. галицептикум и М. инерс. При антигенном анализе 8 штаммов М. галинарум было выявлено 4 серологических типа Л, В, С, Д. При серологическом изучении свойств микоплазм открыто одно интересное обстоятельство. Оказалось, что специфическая иммунная сыворотка, соединяясь с антигеном, способна выполнять роль ингибитора как в реакции нейтрализации вирусов. Это позволило разработать серологическую классификацию микоплазм, изолированных от человека.
В результате многочисленных исследований установлены перекрестные серологические реакции с антигенами гомогенного происхождения и гетерогенного. Человеческие антигены контактируют с антисыворотками птиц. Полагают, что у микоплазм наряду с типоспецифическими антигенами существуют общие антигены.
Антигенные свойства Л-форм бактерии находятся в зависимости от исходного вида бактерий и тех экологических условий, в которых осуществляется Л-трансформация. К настоящему времени является установленным существование Л-форм у многих видов бактерий. Так, они известны у сальмонелл, протея, стрептококка и других. Л-формы несут антигенные свойства родительских культур. Однако эти свойства менее выражены и вопрос о наличии у Л-форм специфического, присущего лишь им Л-антигена остается открытым. Индикация Л-форм бактерий осуществляется в серологических реакциях, в которые включаются не только исходные антигены, но и антигены родительских форм. Л-формы дают полноценные перекрестные реакции с анти¬генами родительских форм и не реагируют с гетероантигенами.

Патогенные свойства. Известно и классифицировано более 30 видов микоплазм, из них многие патогенны для животных и являются возбудителями различных болезней. Заболевания отмечены у крупного рогатого скота, овец, коз, свиней, птиц, собак, кошек, львов, мышей, крыс, от которых выделены патогены. Патогенность микоплазм — их свойство продуцировать гемолизины, эндотоксины и другие продукты жизнедеятельности, которые определяют патогенез. Под влиянием этих продуктов в организме развиваются различные патологические состояния. В инфекционный процесс вовлекаются органы дыхания, молочная железа, суставы, гениталии, нервная система, мочевыводящие пути. Развитие инфекционного процесса зависит от особенностей возбудителя и организма восприимчивого животного. Патогенность удается также выявить в случае заражения культуры тканей. На основании изучения ЦПД делаются попытки классифицировать микоплазмы на 3 группы: первая группа - сапрофиты, которые не размножаются в культуре ткани, вторая — контаминанты, которые присутствуют в ткани, но слабо репродуктивны, третья — патогенные формы, вызывающие ЦПЭ в ткани. Изучение поведения микоплазм в культуре ткани представляет несомненный интерес для установления возможных критериев их дифференциации в пределах данного семейства.
Не менее интересная информация по изучению патогенности имеется и по Л-формам бактерий. Показано, что в эксперименте на лабораторных животных отдельные штаммы Л-бактерий утратили свои вирулентные свойства, но сохранили способность реверсировать в родительские формы. Штаммы Л-форм бактерий, полностью сохранившие исходную вирулентность, встречаются редко. Известны также штаммы Л-форм, которые стабильно сохраняли патогенность. Инъекции этих бактерий сопровождаются выраженным иммунным ответом. Многочисленные исследования Л-форм бактерий обнаруживают перспективу их подразделять на вирулентные и невирулентные формы.
Подмечено, что авирулентные штаммы далеко не безразличные, они длительно могут сохраняться в организме, при многократных инъекциях способны вызывать повышенную реакцию, ведущую, нередко, к летальному исходу. Л-бактерии сальмонелл способны вызывать ЦПД в первично-трипсинизированной культуре ткани, причем этот эффект может быть специфичным. Тот факт, что Л-формы могут длительное время находиться в организме в недиагностируемом состоянии, свидетельствует о возможной их реверсии с последующим выделением в окружающую среду, может служить показателем рецидивов при хронически протекающих заболеваниях. Эти данные подчеркивают возможную роль Л-форм бактерий в инфекционной патологии, выдвигают перспективу к поисковым исследованиям как малоизученной проблемы.

Систематика микоплазм
Вопрос о таксономическом положении микоплазм дискутировался многие годы. В 1960 году Бризоу на конференции предложил относить микоплазм к роду Плевропневмониалес, занимающих промежуточное положение между бактериями и риккетсиями. На второй конференции там же в 1966 коду по систематике микоплазм был учрежден подкомитет по таксономии этих бактерий. В 1970 году Эдвард и Фреиндж предложили объединить различные виды микоплазм, не требующих холестерина для роста, в род Ахолеплазм семейства Ахолеплазматацее.
В определителе Берджи (1980) дается такая характеристика бактериям. Микоплазмы — прокариотические микроорганизмы, имеющие трехслойную мембрану, не имеют истинной клеточной стенки. Клетки мелкие, иногда ультрамикроскопической величины, полиморфны. Способ размножения основательно не изучен. Обычно неподвижны, грамотрицательные. Выращиваются на бесклеточных питательных средах. Колонии мелкие, точечные, врастают в твердые среды. Делятся на патогенные и сапрофиты.
Микроорганизмы относятся к классу Молликутес, порядку Микроплазматалес, включающему семейства Микроплазм и Ахолеплазм. Описание микоплазм приводится выше, виды микоплазм даются в таблице. Оба семейства имеют одинаковые характеристики за исключением семейства микоплазм, которые для своего роста нуждаются в стеринах.

В дополнение к классу Молликутес проводится также информация о бактериях, систематическое положение которых остается неясным. Предполагается, что имеющие сходство с микоплазмами бактерий должны быть подвергнуты обстоятельному, более тонкому изучению с последующим их обособлением в самостоятельный род.

Семейство Микоплазм

Заболевания, вызываемые микоплазмами и их специфическая профилактика

Контагиозная перипневмония крупного рогатого скота.
Инфекционная природа контагиозной перипневмонии крупного рогатого скота известна с 1793 года. Нокар и Ру в 1898 году изолировали микроорганизм, который отнесли к астерококкам, борелломицетам, коккобациллам. Спустя несколько лет, в 1929 году Нокар назвал возбудителя микоплазмой.
Ареал возбудителя в прошлом имел широкие границы, охватывая Евразию, Африку, Австралию и Америку. В условиях современности патология регистрируется почти в 30 странах мира. Из 10 053 вспышек болезни, известных с 1959 по 1967 гг., на долю Европы приходилось 0,63 проц., Азии — 0,69 проц., Африки — 98,17 проц., Австралии — 0,46 проц. и Южной Америки — 0,05 проц. Информация подчеркивает устойчивое состояние Африки по заболеванию крупного рогатого скота. Такое же положение наблюдается и в некоторых районах Азии.
Возбудитель перипневмонии — М. микоидес вар. микоедес. относится к аэробам. К нему не чувствительны лошади, свиньи, собаки, кошки, птицы, морские свинки, крысы И мыши. Патогенен для крупного рогатого скота, коз, овец, яков, бизонов, зебу, северных оленей и антилоп. Полагают, что овцы и козы более восприимчивы, чем крупный рогатый скот.
Источником возбудителя являются больные животные, особенно переболевшие. Распространение возбудителя происходит в результате передвижения животных. В инфекционный процесс вовлекается до 90 проц. животных, летальность достигает 30—50 проц. Эти показатели свидетельствуют о высокой патогенности возбудителя, продуцирующего альфа-гемолизин и другие агрессивные продукты жизнедеятельности.
Микоплазмы имеют нитевидную форму, распадающуюся на гранулы, размер которых от 0,2 до 0,8 мк.
Для выделения и поддержания микоплазм разработано большое количество рецептов питательных сред, из которых признание получили бульон из сердца крупного рогатого скота, а также бульон Мартена. В процессе изучения биоло¬гии возбудителя обнаружена его потребность в дополнительных факторах питания: муцине, РНК, ДНК, в полноценном белке, стеринах и витаминах. Наилучшей добавкой к среде является сыворотка крови лошади или свиньи. Сыворотка крови крупного рогатого скота в отдельных случаях оказывает ингибирующее действие. Из витаминных добавок используются дрожжевые экстракты.
Для выращивания микоплазм ВИЭВ рекомендует использовать наиболее известные питательные среды:
1. Модифицированную ВИЭВ, компонентами которой являются: пептон Мартена, питательная вода, дрожжевой экстракт, стерильная сыворотка лошади или свиньи. Технология приготовления отдельных компонентов состоит в следующем:
а) приготовление пептона Мартена: свежие желудки свиней, не имеющие поражений слизистой оболочки, освобождают от жира и содержимого (кормовые массы снимают влажными салфетками) и, не промывая водой, пропускают через мясорубку. На 250 г фарша добавляют 1 л теплой (50°) кипяченой водопроводной воды и 10 мл концентрированной соляной кислоты. Смесь выдерживают при температуре 45-50° в течение 24 час. периодически взбалтывая, затем прогревают текучим паром 30 мин. Пептон оставляют в холодном месте на 5 суток, прозрачную надосадочную жидкость сливают, фильтруют через бумажный фильтр, разливают в колбы и стерилизуют при 120° в течение 30 мин. Жидкость можно хранить до 3 месяцев;
б) приготовление питательной воды: из мяса, освобожден ного от жира и сухожилий, или из органов (легкие, печень, молочная железа) готовится фарш. К 500 г фарша добав ляют 1 л дистиллированной воды, и смесь выдерживается при температуре 4—8° в течение 24 час. После этого фарш кипятят на слабом огне 2 часа, постоянно подливая воду до первоначального объема. Затем фарш отжимают, воду фильтруют через бумажный фильтр, разливают и колбы и стерилизуют при температуре 120° 30—40 мин. Хранят в рефрижераторе при 4—8°;
в) приготовление дрожжевого экстракта: берут 50 г пивных или пекарских дрожжей, суспендируют и 200 мл дистиллированной воды, кипятят до прекращения вспенивания, фильтруют через бумажный фильтр, а затем через пластинки СФ фильтра Зейтца. Дрожжевой экстракт хранят при 4° не более 15 дней;
г) получение сыворотки крови: кровь от лошадей получают из яремной вены, а от свиней — из передней полой вены. После ретракции сгустка сыворотку фильтруют через стерилизующие пластинки СФ фильтра Зейтца, разливают в стерильные флаконы и хранят в холодильнике.
Для приготовления бульона смешивают в равных объемах пептон Мартена и питательную воду, устанавливают рН в пределах 8,0—8,2; разливают в колбы по 200—100 мл и стерилизуют 30 мин. при температуре 120°. Бульон хранится не более 30 дней. Окончательная величина рП среды 7,8--8,0.
С учетом вида животного и органа, из которого предполагается выделение микоплазм, в каждом отдельном случае для приготовления бульона используется соответствующая питательная вода. Например, при выделении микоплазм из легких свиней к пептону Мартена добавляется питательная вода, приготовленная из легких свиньи, при выделении микоплазм из молока крупного рогатого скота добавляется питательная вода, приготовленная из молочной железы этого вида животных.
2. Плотные питательные среды готовят путем добавления к бульону 1,5—2 проц. агар-агара. Навеску агар-агара предварительно промывают в проточной воде в течение 24 час, затем вымачивают в течение 12 час. в дистиллированной воде (удаление вредных примесей и избытка пигмента), отжимают и расплавляют в дистиллированной воде из расчета 20 проц. концентрации агар-агара. К горячему расплавленному агару добавляют горячий бульон в количестве, необходимом для получения 1,5—2 проц. концентрации агара. После перемешивания среду разливают в колбы, стерилизуют 30 мин. при температуре 120°. Аналогично готовят полужидкие питательные среды (концентрация агар-агара 0,3 проц.). Непосредственно перед употреблением к питательным средам в колбах добавляют 10 объемных процентов дрожжевого экстракта и 20 — стерильной сыворотки крови. Перед внесением указанных добавок агар в колбах расплавляют в водяной бане и охлаждают до температуры 60°. Готовые к употреблению питательные среды разливают в пробирки или чашки Петри, промеряют на стерильность при 37° в течение 1 -2 суток и храпят в холодильнике не более 10 суток. Для улучшения роста микоплазм можно добавлять 0,5 проц. стерильного раствора глюкозы. В качестве индикатора следует использовать для жидких и полужидких питательных сред фенолрот (0,0017 проц.).
3. Среда Эдварда. Среду Эдварда готовят из отвара сердечной мышцы крупного рогатого скота с добавлением 1 проц. пептона.
Отвар сердечной мышцы. Берут 1 кг мышцы сердца крупного рогатого скота, очищают от жира, пропускают через мясорубку и заливают 1 л дистиллированной воды. Экстрагируют 16 час. при комнатной температуре, периодически помешивая. Затем кипятят 40 мин., фильтруют через бумажный фильтр, разливают в посуду и автоклавируют при 120° 30 мин. Отвар хранят при комнатной температуре не более месяца.
Для приготовления бульона Эдварда к 500 мл отвара сердечной мышцы добавляют 500 мл водопроводной воды и 1 проц. пептона. Устанавливают рН 8,4 проц. раствором едкого натра и стерилизуют автоклавированием при 120° 30 мин. Среду используют в течение одного месяца, рН после стерилизации 8,0.
Плотные и полужидкие питательные среды готовят на бульоне Эдварда, добавляя необходимое количество агар - агара.
Перед употреблением ко всем средам добавляют сыворотку крови лошади (20 проц.) и дрожжевой экстракт (10 проц.). Среды проверяют на стерильность и хранят не более 15 дней.
4. Среда Турнера. Мясо и печень молодого крупного рогатого скота по 100 г., желудок свиньи, очищенный от жира и от содержимого, 120 г измельчают в мясорубке. Фарш заливают 1 л дистиллированной воды, добавляют 10 мл концентрированной соляной кислоты. Тщательно размешивают в шуттельаппарате 30 мин. Смесь выдерживают 24 часа при 50°, прогревают при 80° 30 мин. и фильтруют через ватно-марлевый и затем бумажным фильтр. После фильтрования жидкость прогревают 30 мин. при 80° и оставляют на 18—24 часа при 5 - 10°. Холодный раствор фильтруют через бумажный фильтр, устанавливают pН 8,0 путем добавления 10-проц. раствора едкого натрия и прогревают при 80° 15 мин. В остуженный бульон добавляют 1 объемный процент буферной солевой смеси (безводный фосфорнокислый натрий двузамещенный — 3,79 г и фосфорнокислый калий однозамещенный — 90,8 г на 1 л дистиллированной воды). Полученную смесь выдерживают в течение ночи при комнатной температуре (18—20°), фильтруют через фильтровальную бумагу, устанавливают рН 8,0; стерилизуют фильтрованием через пластинки СФ фильтра Зейтца и расфасовывают во флаконы или колбы по 100—200 мл. Перед употреблением к бульону добавляют 10 частей дрожжевого экстракта и 20 частей сыворотки крови лошади или свиньи.
При выборе питательных сред следует учитывать, что среда Эдварда наиболее благоприятна для выделения и поддержания микоплазм от птицы, в то время как модифицированная среда ВИЭВ и среда Турнера могут быть использованы для выделения микоплазм от различных видов животных. Культивирование микоплазм с так называемой «кормилкой» из штамма стафилококков благоприятно влияет на рост. Однако штаммы микоплазм, адаптированные к выращиванию с «кормилкой», не могут быть использованы для серологической типизации вследствие изменения их антигенной структуры.

Успех выделения микоплазм зависит от многих обстоятельств. Материалом для исследования служат различные пробы, взятые стерильно в стерильную посуду и доставленные в лабораторию лучше в замороженном виде. Пробы тканей берутся на границе пораженного и здорового участка органа. При необходимости патологический материал консервируют в 30-проц. водном растворе глицерина. Жидкий патологический материал (кровь, гной, молоко, желчь и др.) доставляются в стерильных пробирках или в ампулах в запаянном виде.
В лаборатории из доставленного материала готовят 20-проц. суспензию на питательном бульоне, центрифугируют, надосадочную часть фильтруют через мембранные фильтры. При этом для подавления сопутствующей микрофлоры добавляют пенициллин и уксуснокислый талий. Растворы пенициллина 100—1000 ед/мл и уксуснокислого талия (1:1500—1:3000) добавляют к 20-проц. суспензии, которую выдерживают 60 мин., после чего делают посев на питательную среду.
Посевы на питательных средах инкубируют в термостате при 37° и ежедневно в течение 10 дней просматривают, обращая внимание на наличие опалесценции в жидких средах и на характер колоний в твердых средах. В случае отсутствия роста на сывороточных средах проводят не менее 5 пассажей с пятидневными перерывами на таких же средах. Если при этом рост будет отсутствовать, то такой материал считают свободным от микоплазм.
Для выделения микоплазм можно использовать культуру тканей и 6—7-дневные куриные эмбрионы. Необходимым условием при этом является, чтобы культура ткани и куриные эмбрионы были свободны от контаминированных микоплазм.
Микоплазмы, как говорилось выше, имеют много общих черт с Л-формами бактерий. Дифференциацию их проводят на основании результатов пяти пассажей с интервалом в 5 дней. Учитывают то обстоятельство, что нестабильные Л-бактерии при пассировании на сывороточных средах способны реверсировать в родительские формы. Если реверсии культуры не происходит, то ее относят к микоплазмам.
Детальное изучение колоний выполняют на препаратах-отпечатках, приготовленных по одному из методов:
а) вырезают кусочки агарового блока, которые кладут колониями вниз на покровное стекло. Фиксируют в жидкости Буэна 12—18 час, промывают водой, окрашивают по Романовскому-Гимза 18—24 часа, промывают водой и микроскопируют;

б) агаровый блок 1X1 см помещают на предметное стекло, слегка придавливают и погружают под углом 45° в воду, подогретую до 90°. Агар при этом расплавляется, колонии прилипают к стеклу. Затем отпечатки высушивают, окрашивают и микроскопируют;
в) на стекло наносят краску Динса, подсушивают и накладывают агаровый блок колониями к краске на 15—20 мин. Затем стекло погружают в горячую воду для расплавления arapa, препарат высушивают, окрашивают и микроскоппруют.
Тинкториальные и морфологические свойства бульонных культур изучают в мазках, приготовленных из отмытого осадка (центрифугируют 30 мин., при 10—15 тыс. об/мин.). Мазки высушивают, фиксируют в метаноле, ацетоне или в спирт-эфире, высушивают и окрашивают по Граму и Романовскому-Гимза (1:10) 3 - 4 часа. Структурные элементы микоплазм окрашиваются в светло-фиолетовый цвет. Микоплазмы грамотрицательны. ,
Типизацию микоплазм проводят комплексным методом. Применяют реакцию агглютинации, пробу задержки роста методом диска, пропитанного антисывороткой, ингибицию обмена веществ, РСК, РП в агаровом геле, реакцию гемагглютинации и иммунофлуоресценции.
Выделенные культуры микроорганизма необходимо так¬же дифференцировать по биохимическим свойствам (табл. 1), отличать от Л-форм бактерий (табл. 2).

Таблица 1. Биохимические свойства микоплазм (ВИЭВ)

Таблица 2. Дифференциация микоплазм от Л-форм бактерий и псевдоколоний (ВИЭВ).

Инфекционная плевропневмония коз. Возбудителем является М. микоидес вар. капри, относится к аэробам, имеет форму мицелия, распадающегося на гранулы, величиной 0,2—0,8 мк. Микроорганизм отличается от возбудителя по антигенным свойствам.

В естественных условиях к возбудителю чувствительны только козы. Из лабораторных моделей иногда удается заразить мышей и куриные эмбрионы. Болезнь распространена в странах Африки и Азии.
Контагиозная агалактия овец и коз. Возбудитель открыт Бридре и Донатьеном в 1923 году. Микроорганизм относится к аэробам, образует мицелий, распадаю¬щийся на фрагменты величиной до 0,2 мк. Другие биологические свойства типичны для микоплазм. Размножается в куриных эмбрионах.
Э н з о о т и ч е с к а я пневмония телят. Заболевание отмечается в хозяйствах, занимающихся откормом. Возбудитель достаточно не изучен. Его обозначают как микоплазма Т, особенностью которой является образование зернистых и очень мелких колоний, величиной до 1000 мк.

Маститы. При патологии вымени выделяются микоплазмы различных сероваров: М. бовигениталиум, М. агалактие вар. бовис или М. бовимаститидис, а также апатогенные виды, вызывающие субклинические формы заболевания молочной железы.
Кроме этого, довольно часто исследователи выделяли микоплазм из половых органов при перегулах, бесплодии. Их обнаруживали в сперме быка. Считается общепризнанным, что микоплазмы играют значительную роль, вызывая патологию гениталий, бесплодие.
Энзоотическая пневмония свиней. Иссле¬дуя причины энзоотической пневмонии свиней, многие ученые (Бакос с соавторами, 1962, Свитцер, 1953, 1954; Фриз, 1971 и др.) обнаружили патогенную роль микоплазм в ее возникновении. Ныло доказано, что пневмонию у свиней могут вызывать несколько видов микоплазм: М. гиоргинис, М.гиопневмоние, М. гранулярум и др.
В настоящее время, кроме крупного рогатого и мелкого рогатого скота, а также свиней, известны микоплазмозы различных видов птиц, собак и грызунов. Патогенная роль микоплазм этим не исчерпывается. Они играют определенную роль как контаминанты культур тканей куриных эмбрионов, что является серьезным препятствием в использовании этого теста и производственных к научно практических целях.
Для диагностики и профилактики отдельных микоплазмозов биопредприятиями выпускаются препараты. В частности, для активной профилактики инфекционной плевропневмонии коз готовят гидроокисьалюминевую формолвакцину. Вакцина представляет собой 10-проц. суспензию гомогенизированных тканей, содержащих микоплазмы, в фосфатно-буферном растворе. Материалом для приготовления вакцины служат органы, ткани, жидкость грудной полости, взятые от вынужденно убитого животного в острый период болезни.
Вакцину применяют подкожно. Коз в неблагополучных пунктах прививают дважды через 7 дней, в угрожаемых — однократно. Иммунитет развивается в течение 7—12 дней и длится в течение года.
Для диагностики микоплазмоза птиц выпускают антиген. Материалом для его изготовления являются культуры микоплазм, выращенные в жидкой питательной среде, состоящей из триптического гидролизата мясного фарша с 10 проц. кислотного гидролизата печени, 20 проц. сыворотки крови лошади, 0,5 проц. глюкозы и 0,025 проц. ацетата таллия. Антиген применяют в сывороточно-капельной реакции агглютинации (СКРА) на стекле для постановки группового диагноза на микоплазмоз.
Л И Т Е Р А Т У Р А
1. Тимаков В. Д., Каган Г. Я. Семейство микоплазм и Л-форм бактерий. «Медицина», М., 1967.
2. Серебряков А. С, Грошева Г. А., Шубин В. А., Респираторный микоплазмоз птиц. «Колос», 1970.
3. Бюллетень ВИЭВ, вып. XIII, 1972.
4. Коваленко Я. Р. (ред.) Микоплазмы животных. «Колос», 1976:
Св. пл. 1983 г., поз. 351.
Кирьянов Едисей Автомонович
МИКОПЛАЗМЫ И Л-ФОРМЫ БАКТЕРИЙ В ПАТОЛОГИИ ЖИВОТНЫХ
Сдано в набор 18.V.-83 г. ВД 04616. Подписано к печати 28.11-83 г. Формат 60x8471/16 Объем 1,5 п. л. Заказ 1555. Тираж 500.
Цена 10 коп.
Типография № 3 Управления издательств, полиграфии и книжной торговли Приморского крайисполкома.
г. Уссурийск, ул. Тимирязева, 67.

Эта лекция воспроизводится по оригинальному изданию 1983 года. Ссылка на этот сайт (vetfac.narod.ru), и на автора лекции (Кирьянов Едисей Автомонович) обязательна.